发酵液（fermentation broth），指的是液体培养基接入微生物菌种，经过一段时间培养后，微生物利用培养基中的营养成分， 合成菌体及分泌产物，这种经微生物代谢后的液体叫发酵液。

中文名：发酵液

外文名：Zymotic fluid

领域：农业科学

食用菌发酵液中蛋白质的研究

食用菌是蛋白质和氨基酸的良好来源, 食用菌中的蛋白质含量高, 蛋白质消化率高, 在人体消化酶的作用下分解成氨基酸而被人体吸收, 具有较高的营养保健价值, 可促进婴幼儿健康成长和智力发展。常用的蛋白质提取方法主要有水溶液辅助超声波、微波提取法, 有机溶剂提取法, 酶解法, 反胶团萃取法, 双水相萃取法。食用菌蛋白质具有药物活性, 抗肿瘤、调节免疫、抗氧化是主要生理功能, 食用菌发酵液中蛋白质成分更具有直接抗肿瘤的作用。随着蛋白质分子量的增加, 将主要起营养作用, 功能作用逐渐衰弱, 发酵液中的氨基酸、多肽研究日益广泛, 发酵液中的大分子蛋白质主要以酶的形式发挥作用。蛋白质纯化技术常采用透析、超滤、离心、分子筛、琼脂糖凝胶、Ni-NTA树脂、DEAE纯化技术等。透析和超滤技术可以实现蛋白质与金属离子的分离, 分子筛和树脂纯化可以得到不同分子量大小的凝胶, 但是这些纯化过程得到的蛋白质会伴随产生很多杂质, 为了进一步纯化还需要进行DEAE纯化。得到的蛋白质溶液进行电泳分析, 如果所含蛋白质种类不多, 可以直接进行硫酸铵盐沉淀, 此时蛋白质纯度也比较高。

食用菌发酵液中多糖的研究

食用菌多糖中发挥活性成分是具有分支的β- (1, 3) -D-葡聚糖, 食用菌中生物活性最显著、含量最高的是多糖, 因此对食用菌发酵液多糖的开发利用研究的最彻底。多糖极难溶于有机溶剂, 一般采用热水浸提、稀碱浸提、强酸浸提的方法提取, 对于多糖而言, 超声波辅助提取多糖得率高于微波提取。强酸性条件下, 多糖含有醛酸等酸性基团极难溶于酸性条件, 因此使得酸提多糖呈碱性, 碱提条件则正好相反。将浸提液进行离心、浓缩后用乙醇沉淀得到粗多糖, 分子量大的多糖聚集在乙醇液面上, 分子量小的则聚集在底部, 食用菌发酵液多糖的提取过程中, 多糖粘性大极易吸附蛋白质和色素, 影响多糖纯度和生物活性效果, 需要经过真空浓缩、Sevag法去除蛋白质、H2O2脱色、透析等处理后可以得到粗多糖, 经离子交换柱和凝胶柱纯化即可得到纯多糖。多糖纯度越高越稳定, 越不易变质。真空浓缩体积到1/4, 浓缩浓度越大, 多糖越容易醇沉, 但是浓缩过程中容易导致多糖降解造成损失, 时间不宜太长。食用菌多糖随提取温度增加得率增加, 温度超过90℃后多糖降解加快, 提取温度一般不宜超过90℃。脱蛋白、色素、透析纯化多糖过程中会导致多糖的降解与结构改变, 而且分子量也会受到影响, 单糖之间的连接键受到破坏, 多糖整体的氧化还原能力会发生变化。柱层析纯化多糖通过多糖的极性及多糖的分子量大小进行分离, 得到的多糖较符合天然多糖的结构, 条件比较温和, 而且多糖损失量少, 但对上柱的多糖纯度要求高, 杂质较多会导致层析介质的堵塞, 影响纯化效果。一般柱层析之前需要进行脱蛋白、色素、透析处理。

食用菌发酵液中萜类化合物的研究

萜类化合物是异戊二烯、异戊烷以各种方式连接形成的天然化合物, 精油中含量丰富, 在食用菌中, 三萜类化合物及倍半萜类化合物较多, 含有27~30个碳原子, 6个异戊二烯单位, 其前提是鲨烯。三萜类代表性物质是具有抗疟疾作用的青蒿素。三萜类化合物主要采用有机溶剂提取法, 利用超声波、微波辅助提取, 超声提取法、超临界流体萃取法和制备衍生物法。主要采用氯仿、甲醇、乙醇等有机溶剂提取, 水溶性极差。超声波、微波提取工艺有利于提高三萜物质提取率, 且提取物质稳定性比较高。萜类物质对热敏感, 提取温度不宜过高。萜类物质主要测定方法有重量法、比色法、薄层色谱 (TLC) 法、高效液相色谱 (HPLC) 法、气相 (GC) 法。三萜类物质的纯化采用大孔吸附树脂法及硅胶柱层析法, 大孔吸附树脂得到的帖类物质比较粗糙, 含有色素等杂质, 之后需要进行采用硅胶柱层析进一步纯化, 洗脱剂常用氯仿-甲醇-水体系。

食用菌发酵液中核苷酸的研究

核酸是由许多含氮的碱基、磷酸、核糖或脱氧核糖三种分子构成核苷酸, 核苷酸间通过3', 5'-磷酸二酯键聚合而成的生物大分子物质, 属于生命物质。核苷酸可采用微波、超声波、研磨珠、冻融法对核苷酸进行提取。核酸水解产物常采用离子交换树脂、反相液相色谱法、毛细管电泳、薄层电泳、离子对色谱法分离, 核酸与蛋白质分别在260 nm和280 nm处有最大吸收峰, 因此, 核苷酸的纯度可用A260/A280的比值来判断。离子交换树脂可以根据核苷酸的等电点不同进行分离, 不同的核苷酸种类需要不同的洗脱剂, CMP需要用甲酸洗脱, GMP需要Na CL洗脱, UMP则需要甲酸与甲酸钠混合液洗脱。液相色谱法及电泳技术常用于实验室核苷酸种类的鉴定, 不适合大规模分离纯化, 不利于核苷酸的积累。

核苷酸类物质对细胞增殖、蛋白质合成具有调控作用, 可以作为诱导因子抑制癌细胞的增殖, 其中5'-核苷酸是常用抗病毒抗肿瘤药物原料。此外, 食用菌中的核苷酸类物质起到增鲜的作用, 是提取食品调味料的重要原料。庄玮婧等对食用菌发酵液中的核苷酸进行了测定得出灵芝发酵液的核苷酸质量浓度最高, 并且灵芝在发酵的第三阶段各成分含量达到最高。Tang J P等从冬虫夏草中提取核苷类物质虫草素, 并采用高效液相和紫外分析仪测得纯度高达90.54%, 进行细胞增殖抑制试验发现虫草素对SH-SY5Y细胞没有抑制作用, 在浓度133μmol/L条件下对RM-1细胞达到半数清除率。核苷酸的功能性研究较少, 更多的是作为一种鲜味剂进行研究。

通过增加发酵液中Fe2+, 茉莉酸甲酯含量可以增加食用菌次级代谢核苷酸类物质的产生, 可以作为信号分子调节核苷类物质的代谢从而促进核苷类物质的产生与释放。核苷酸类作为胞内成分, 发酵液中含量比较少, 可以通过核苷酸的含量研究食用菌生长过程中的细胞代谢活动。

食用菌发酵液中多酚的研究

多酚是有儿茶素和表儿茶素通过C-C键组成的大分子化合物, 食用菌中的多酚类物质来自于次级代谢产物。酚类检测常用Folin酚法、高锰酸钾法、酒石酸亚铁法, 紫外分光光度法等, Folin酚法由于操作最简捷, 用时最短应用最广。采用溶剂萃取法、超声波辅助提取、超临界流体、微波辅助提取法、亚临界水提取法、生物酶提取法及膜技术提取法等进行提取。丙酮对多酚的提取最好, 且沸点低, 对正常细胞毒害较小, 应用广。多酚的纯化比较简单, 采用大孔树脂即可获得纯度在65%的多酚, 树脂纯化弊端在于得到的多酚物质常含有大量的黄酮类物质, 洗脱液需要进行降酮处理, 铝盐沉淀黄酮类物质, 多酚纯度越高, 颜色越浅。

2 食用菌发酵液功能性成分在生产中的应用

由于发酵液中包含食用菌的各类代谢物, 发酵液中的活性物质种类复杂多样, 就同一物质而言, 由于其培育菌丝体不同, 所得发酵液不同, 发酵液的功能活性与菌丝体是密切联系的。有些食用菌中含有三元配合物, 例如氯霉素, 不仅广泛存在于菌丝体中, 数十种真菌深层发酵液中含量颇丰, 最高达38.6μg/L, 具有明显的抑菌效果。液体发酵液活性成分除了用于医疗保健行业, 化工行业也将研究目光投向液体深层发酵液。张代佳等采用超滤醇沉法提取1, 3-丙二醇, 用于生产化纤产品聚对苯二甲酸丙二酯 (PTT) , 由于食用菌发酵液成分复杂1, 3-丙二醇很多情况下难以进行纯化分离。

食用菌发酵液成分除了未被利用的营养成分纤维素、半纤维素等, 还包括一些食用菌的初级、次级代谢产物, 这些物质具有功能活性, 对人类具有重要的研究价值。食用菌发酵液的功能活性与萃取溶剂密切相关, 方熹君研究发现正己烷萃取虎奶菇发酵液没有生物活性, 丁醇萃取物具有明显的抑菌活性, 得出脂溶性小分子抑菌效果好的结论。席亚丽等研究荷叶离褶伞发酵液中的营养成分发现其维生素含量最为丰富, 主要是B族维生素和Vc, Vc含量高达27.8 mg/100g, 此外, 小分子氨基酸含量丰富, 不含有重金属, 可利用价值高。林陈强等研究发现虎奶菇液体发酵液中可以提取抗生素:2-呋喃甲酸, 酸性物质, 具有良好的抑菌作用, 不耐高温、强碱。

菌体细胞和蛋白质等杂质的存在, 会使发酵液黏度升高, 影响后续的分离操作, 特别是在精馏过程中, 随着水分减少, 发酵液逐步呈粘稠状, 使PDO的分离变得更加困难, 甚至结焦污染换热器, 因此第一步需要对发酵液预处理, 除去上述杂质。

1 离心

离心是一种常见的固液分离方法, 可以很好的除去菌体和蛋白质等大分子物质, 但由于需要较高的转速, 而且样品处理量较小, 导致设备投资和能耗很高, 不适合工业化生产。

2 膜过滤

该法是利用具有一定选择透过性的过滤介质对目标物质进行分离, 常见的有微滤、超滤、纳滤, 可根据各物质分子量的不同进行分离。发酵液的预处理一般可以利用超滤膜过滤除去发酵液中的大分子物质。

3 絮凝

絮凝就是通过添加絮凝剂, 使液体中不易沉降的悬浮颗粒聚集成团, 从而易于沉降。

4 双水相萃取

当亲水性有机溶剂 (小分子醇和酮) 与水和无机盐以适当的比例混合时, 会出现液液分层的现象, 该双水相体系被称为新型双水相体系。在此新型双水相体系中, 发酵液中的PDO及其他醇类物质 (比如残余甘油) 主要进入有机相 (萃取相) , 而发酵液中的其他成分主要进入水相 (萃余相) , 可去除发酵液中的绝大部分菌体、蛋白质、盐以及其他杂质。